探针的设计软件(探针的设计软件有哪些)

舞蹈048

今天给各位分享探针的设计软件的知识，其中也会对探针的设计软件有哪些进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在开始吧！

本文目录一览：

荧光定量PCR的Tapman 探针引物怎么设计

这个不同的基因Taqman的探针不一样，它不是通用的，是专一性的，是某个基因的某段序列。然后你选一段小的位置来做为探针，两端分别加上发光基团与淬灭基团，正常情况下他们不发出信号，在PCR扩增的时候他就会自己结合到目的基因上，然后通过Taq酶的外切酶活性将其切端而发出信号。TaqMan引物没什么特别，特别之处就是有第三方带有发光基团与淬灭基团的序列段。

探针的设计软件(探针的设计软件有哪些),第1张

各种引物探针设计软件计算出来的Tm值该怎么考虑？相差太大。如primer 5、primer express、oligo等。

正常primer5设计引物时，Tm在40~70之间都没有问题，基本在PCR时候按照引物合成公司给的TM值进行试验，都没有问题！除非你的引物设计的有问题。

定量PCR Taqman探针设计与体系优化

目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

之一步：在之一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：

先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的更好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

序列选取应在基因的保守区段

避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构

典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性更高），GC含量在40%－60%

引物之间的TM相差避免超过2℃

引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基

为避免基因组的扩增，引物设计更好能跨两个外显子。

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp

引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

探针位置尽可能地靠近上游引物

探针长度应在15-45bp（更好是20-30bp)，以保证结合特异性

检测探针的DNA折叠和二级结构

Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%

探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

为确保引物探针的特异性，更好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。

探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。

Tm值应为65-67℃。

尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。

尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。

原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。

注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp，探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种 *** 是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。

　

第三步：寻找一家信赖的公司合成引物和探针，一般引物合成大家比较熟悉，而且价格也比较便宜（特别是这两年便宜了许多），而探针则相对来说贵了许多，一般Taqman探针合成在1000到5000元不等（不同的合成要求价钱不同）——而这只是标记价钱，序列合成基本上和引物合成价钱相似。

第四、五、六步：一般的定量PCR反应体系与普通PCR其实也差不了多少，只是要加入Taqman探针，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：

扩增酶更好选用热启动酶

引物和探针的浓度需要进行优化，有人建议从50nM开始，在50nM—900nM之间优化，一般为200nM（注意探针需要避光保存。

同样Mg+和酶量也需要进行优化，酶的推荐反应浓度是1.25-1.5U（50ul）

DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定更佳的DNA模板添加量。如果欲进行2 Step RT-PCR反应的第二步PCR扩增反应，之一步的RT反应液作为DNA模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

另外循环参数虽然在引物和探针设计完之后也就确定了，但是有时也需要进行优化。

第七步：在进行数据分析的时候，通常用不同浓度的标准样品的Ct值来产生标准曲线，然后计算相对方程式。方程式的斜

度可以用来检查PCR的效率，对于100%PCR效率来说，一个理想的斜率是3.32。更佳的标准曲线是建立在PCR的扩增效率为90%-100 %(100%意味着在每个循环之后，模板的总数将增加为前一次的2倍)的基础上。所有标准曲线的线性回归分析需要存在一个高相关系数(R2≥0.99) ，这样才能认为实验的过程和数据是可信的。使用这个方程式我们可以计算出未知样本的初始模板量。大多数定量PCR仪都有这样一个软件，它可以从标准曲线中自动地计算出未知样本的初始模板量。

这其中有两种基本的 *** ：绝对定量和相对定量，研究人员需要根据自己的实验目的来选择。绝对定量是指将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，要注意得是绝对定量分析的准确性是相对标准品的准确性而言的。相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率，没有确切的数字被检测道。

另外由于不同的样品在反应过程中存在着一定的差异，因此除了要 *** 标准曲线来进行定量外，还需要设计表达水平相对较为稳定的内参基因来对结果进行标准化。β-actin 和三磷酸甘油醛脱氢酶( Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH) 是两种较常用的管家基因，另外还有cyclophilin，18sr RNA ，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthine ribosyl transferase，transferring receptor 等。要注意这些基因可以被反应条件所影响，在设计定量表达研究时，保证初始对照基因的质量是必要的一步，而且严谨的研究人员会通过对一系列内参基因定量结果取几何平均数来对定量数据进行标准化。

还有一个问题就是如何判断所得到数据的好坏，关于扩增曲线，经验总结认为：

“1. 总体看曲线拐点清楚，指数期明显，扩增曲线整体平行性极好，基线平无上扬现象，低浓度样本扩增曲线指数期明显。

Mg2+的浓度是影响Taq酶活性的关键因素， Mg2+浓度过低可影响Taq酶更佳活性的发挥，Mg2+浓度过高，会增加非特异性扩增 。

一般来说， 以DNA或cDNA为模板 的Real-time qPCR反应，应选择 2～5mmol/L 的Mg2+浓度，以 mRNA为模板 直接进行的反应，应选择浓度为 4～8mmol/L 。

模板的浓度应根据Ct值进行选择，一般而言，使 Ct值位于15～30个循环之间比较合适 ，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Ct值小于15，则应降低模板浓度，如果研究者是进行 首次实验 ，那么应选择 一系列稀释浓度的模板 来进行实验，以选出最为合适的模板浓度。

对于一些 成分复杂样本（土壤、沉积物等） 的Real-time qPCR反应，此时提取的DNA模板中通常含有较多的腐殖质等物质，其会 抑制PCR反应 ，导致扩增效率下降，从而使对 目的基因的定量准确性降低 。

通常采用用 对DNA模板进行稀释 的 *** 消除PCR抑制，但是某些情况下，由于模板量较少，稀释的办法并不适合，就需要对模板进行额外的纯化。

引物浓度太低会致使反应不完全，若引物浓度太高，则发生错配，并产生非特异性的扩增产物。 对于大多数PCR反应，0.5μmol/L是适宜的引物浓度 ，若初次实验结果并不理想，可在 0.3～1.0μmol/L 之间进行调整。

Real-Time qPCR所用 引物的纯度至少要达到PAGE级 ，如使用OPC级引物会造成结果的不准确。

通常目的基因PCR产物熔解曲线的峰出现在80～90℃之间，当 熔解曲线在70～80℃ 范围内出现一个 荧光强度较小的峰 时，表明Real-time qPCR反应有 引物二聚体 生成。

此时首先要判断引物二聚体产生的原因，如果在高目的基因拷贝样品中没有出现引物二聚体，而只在低目的基因拷贝样品中存在引物二聚体，此时引物二聚体的出现是由于 样品中目的基因含量过低 ，导致引物过量而发生自我匹配，可以通过 增加模板使用量或减少引物使用量 的方式消除引物二聚体。

另一种消除引物二聚体的方式是 提高退火温度 ，但是并不是一定有效，建议在进行Real-time qPCR之前更好通过 温度梯度PCR 的方式检验引物是否会形成二聚体，同时确定合适的退火温度。

在绘制目的基因标准曲线时，经常会遇到扩增效率偏差较大的问题。

可以在反应体系中添加 500μg/mL的BSA（牛血清蛋白） ，BSA能够稳定低浓度的核酸模板，同时 提高扩增效率 。

短的PCR产物比长的PCR产物扩增效率高 ，这是因为短的产物在95℃时更易变性，使引物和探针在退火阶段更有效地与其互补序列结合，降低来源于基因组扩增的污染，同时缩短了扩增时间。

提高退火温度 可以提高PCR反应的特异性和扩增效率，必要时可以 将退火温度提高至60℃以上 ，并去除72℃的延伸阶段， 将退火和延伸合并为一个阶段 进行，以保证目的基因的扩增效率。

如标准曲线的 扩增效率高于100%较多 ，多数是由于标准品梯度稀释过程中 操作失误 ，导致稀释倍数较多的 低浓度标准品不准确 ，应 重新对标准品进行稀释 后再次绘制标准曲线。

参考：生物通

求oligo 7软件使用说明或者教程。

Oligo使用 *** 介绍

作为目前更好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能：如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。

在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的实验情况，导入模板有三种 *** ：

1， 直接用键盘输入：

a， 点击file菜单中的New Sequence 浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令，进入序列展示窗口；

b， 此时即可键入DNA序列；

c， 如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit菜单中的“Readback on”即可。

2， 利用复制和粘贴：当我们序列已经作为TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。

3， 如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文件。

点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。

进入引物设计模式后，oligo一般会弹出三个窗口，分别是6－碱基频率窗口，碱基退火温度窗口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗口则在设计过程中起辅助作用，比如6－碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5’端稳定性是否稍高于3’端等。

一，普通引物对的搜索：

以Mouse 4E（cDNA序列）为例。我们的目的是以Mouse 4E（2361 bp）为模板，设计一对引物来扩增出600－800bp长的PCR产物。

1，点击“Search“菜单中的”For Primers and Probes“命令，进入引物搜索对话框；

2，由于我们要设计的是一对PCR引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。

在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3’端高度特异，GC含量有限定，d，去除错误引发引物等。

3，剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。

①单击：“search Ranges”按钮，弹出“Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：1－2000，下游引物的位置：100－2300；PCR产物的长度600－800bp。

②单击“Paramaters”按钮进入“Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同设定，参数以及更多参数。

③在“普通设定”窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定 *** ，从高到低分六个等级，最后还有一个用户定制选项。

④当我们对引物的各种参数的含义及应该设定多大值并不是特别清楚时，就可以直接设定Very high/High等来完成对引物设计参数的设定。

⑤当我们选中“Automatically Change String”后，Oligo会在引物搜索过程中：如果在高等级设定中无法找到引物对时自动降低一个定级来进行搜索，知道找到引物对。在设计反向PCR引物对时，就选中“Inverse PCR”复选框。

⑥我们还可以让引物的长度可以改变，以适应设定的Tm值或PE？（Prime Effitions，引发效率）。也可以限定所选引物对的更大数目。

⑦在“Parameters”窗口中，实际上需要我们改动的只有引物的长度，根据试验的要求作相应的改变，如23nt。其他参数就使用Oligo的默认值，一般无需改变。在“More Parameters“窗口中，一般也无需作任何改变，直接用Oligo的默认值。

4，点击“确认”－“Ok”进入搜索窗口，再次单击“OK”后，Oligo自动完成引物对的搜索，并出现一个搜索结果窗口。显示出得到的引物对数目。

5，点击“Ok”，出现“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7对引物的简单信息，引物位置，产物长度，更佳退火温度及GC含量。单击“Sort”按钮，可以按产物长度，更佳退火温度及GC含量从小到大或从大到小的顺序排列。

6，点击任意一对引物，在旁边马上弹出一个叫“PCR”的窗口，在窗口中我们可以看到这对引物在模板中的大概位置，更佳退火温度（该温度可以直接应用于我们实际PCR中的第二步退火）。另外还有引物的Tm值，GC含量，引发效率，同时还计算出了产物的Tm值于引物Tm值的差异以及引物间Tm值的差异。一般我们尽量保持前者在20度以内，后者在5－6度以内。点击不同的引物对时，PCR窗口内容同时作相应的改变。

7，要想了解引物的详细信息，如二聚体，发卡结构形成情况、组成、Tm值和错误引发位点等，这时只需点击“Analyze”菜单中的相应命令，就可以分别得到相关信息。例如点击“Duplex Formation”，我们就可以得到上游引物间，下游引物间及上下游引物间形成二聚体的情况。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就可以显示出相关信息。所有这些分析的结果都有助于我们从Oligo搜索得到的多对引物中选择更佳的引物对。

需要说明的是，1，如果一次搜索得到的引物对太多时，我们可以适当提高选定的条件和规定更合适的搜索范围来减少引物对数；2，引物一般尽量不要在3’端或是离3’端太近的位置形成二聚体，同时二聚体的自有能绝对值尽量小于10；3，对于错误引发，在普通PCR中，如果引发效率在160 points以上时，就可能出现杂带，在测序反应中，错误引发效率则应该严格控制在120 points以下。

8，Oligo中每对引物的详细信息可以直接导出为一个文本文件：

首先点击“File”菜单中的“Print/Save Options”，在出现的对话框中的普通设定选中“Selected”；在“Analyze I”中选择需要保存的信息，在“Analyze II”中选中PCR。

单击确定按钮退出，这时再次点击“File”菜单，Save浮动命令中的“Data Save as”，选择路径及文件名即可。

二，测序引物的设计：

在oligo中，测序引物设计过程与普通引物设计大部分都很相似。

还是以Mouse 4E为例，假如我们要在600－800bp的位置设计一条测序引物。

Open－Search

在“Search”窗口中，选中“Sequece Primer”，同时去除负链Search的选中

在“Search Range”窗口，输入正链的600－800bp

在“Parameters”中选定 very high ，引物长度改为18bp

结果得到11条测序引物，与普通引物同理，根据其详细信息就可以挑选到一条更佳的测序引物。

三，探针的设计：

探针的设计与测序引物设计基本相同，只需使“Search”窗口的探针设计选中，改变探针的长度就可以。

四，评估引物对：

我们在各种文献中查到的引物，如果直接进行PCR，往往很难重复别人的实验结果。这时就想到，是不是引物的质量有问题？能不能用软件来对这些问题引物进行一些分析呢？答案时肯定的。

1，点击File菜单中的New命令；

2，在“Edit New Sequence”的窗口中用键盘输入上游引物；

3，如果该引物的首位置不是1的话，可以在“Edit”窗口中输入新的5’端位置数字，如20；

4，点击Accept/Discard菜单的Accept命令；

5，如果引物序列长度不同于当前的引物的话，可以从“Change”菜单中改变当前的引物长度；

6，选取当前序列为上游引物（点击“upper”按钮）；

7，从Edit菜单中选取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中输入下游引物的序列；

8，在Edit窗口的上角处，输入相应的5’位置；

9，选取“Accept and Quit”命令；

如果想让程序给出更佳退火温度，在此时的对话框中输入PCR产物的长度以及GC含量所占百分比，一般哺乳动物的cDNA序列中GC大约占44％。

10，点击OK就可以在“Analyze”菜单中完成各种分析了。

心得

yvette wrote:

对于作PCR的来说，最难的莫过于设计引物了，理论现在已经很多了，但是真正实践起来是要付出一定的心智的，记得曾经看到某一位主任说他设计了上千对引物，从没有失手的时候，真是让我佩服得五体投地。

最近看了一下OLIGO6.0的使用说明，英文的，感觉有很多地方还是讲得不很明白，比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.

下面我先来讲讲普通的利用OLIGO 设计引物的 *** 吧：

1 从文件菜单打开模板序列，当然，不是随便什么序列都可以打开的，要有特定的格式，一般扩展名为 *.seq的序列可以直接打开，或者就从文件菜单选择new sequence打开一个空窗口，然后利用复制/粘贴也可以导入模板序列，或者直接在该窗口中写，然后要打开文件菜单旁边的 accept 菜单，选accept就可以了；这时候有三个窗口，重叠在一起，很不方便看，可以从window菜单选Tile，这样，三个窗口就平行排列了。

2 从search菜单选primers and probes，打开了引物搜索窗

3 点黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圆孔

4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾

5 如果在PCR中可能存在其他的模板，要想使所设计的引物与该模板不会形成错配，可在 And continue above search in other files 的条目前方格中打勾，这时会出现一个新的 select files窗，导入可能会形成错配的模板序列。点OK

6 点Search ranges按钮，输入你想要的上游和下游引物在模板序列上的区间及想要的产物的长度，点OK

7 点parameters 即引物参数按钮，一般将搜索严谨性设为high，如果搜不到，再降低严谨性，另外，在adjust length to match Tm's前的方格中打勾。点OK

8 点击OK开始自动搜索

9 搜索完成后，在search status窗口的下部选show:primer primers, 点OK

10 得到的引物可以根据位置、长度、退火温度及GC含量进行排序（sort)

11 点击您所想要的就打开了一个窗口显示引物的位置、退货温度、GC含量、PE(Priming efficiency 引发效率)等。

12 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击 upper primer 和lower primer 就可以将您所需要的上下游引物序列导入到数据库中，至于如何生成引物报告单我就不甚了了，感觉这个功能不如primer premier好使。还希望知道如何使用的兄弟不吝赐教一下叻。

Nested Primer pairs Search

与上述自动搜索差不多，有一下几点不同：

1 打开search菜单后，不要选定 “ And continue above search in other files ”

2 打开parameters菜单后，注意不要选定“ Inverse PCR” 框 ，同样选定“adjust length to match Tm's” 框

3 开始搜索后得到结果显示在“Primer pairs"窗口中，从 *** yze菜单中 选定multiplexing,得到一个显示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口，直接在该窗口中选择您所要的引物，在您所要的引物的小方块上点击一下，positive strand primer 选定后就从红色变成了绿色，negative strand primer 选定后就从蓝色变成了绿色。先选择巢式PCR的一对外引物，然后选择一对内引物，选定后点击pairs就打开了显示您所选定引物的窗口

4 从文件菜单点击"New Database" ，然后从import菜单点击multiplexed primers就将您所选定的引物导入到一个数据库中，保存。

好像从export 菜单可以生成order form, 但是我实在是太木了，这都大功告成了，到了最后又歇菜了。

还有很重要的功能如搜寻 consensus primer pair 和搜寻 unique primer pair 来扩增同源性的模板，比如后一个应该就是设计扩增许多同源性很高的序列的保守区吧，我以为我已经找到了尚方宝剑了，可是三条序列试了一下，这三条序列经过 multiple align后有很长一段是保守的，您猜怎么着，等了好几分钟，结果没有找到，我又用十条序列，干脆就死机了，可能这一功能需要很大的内存才能使用。也许是我还没有找到窍门，有知道的还请教教我。

如何设计荧光定量PCR的引物及TaqMan探针

（转载，仅供参考）

a) 针对双标记探针的引物和探针设计的规则

所选序列应该高度特异。应该选择具有最小二级结构的扩增子。这是很重要的，因为二级结构会影响反应效率。在任何实时应用中期望获得100%的扩增反应效率，这意味着每次循环中，体系内的扩增子都有两倍的增加。如果二级结构在热力学上比寡聚目的基因更稳定，那目的基因的杂交将会失败。二级结构还会阻碍酶的扩增。如果扩增子的二级结构不能避免，则引物的退火温度要相应提高。在整个过程中，我们要进行BLAST和类似的分析，以确保特异性。

通用原则

1， 先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近于探针。

2， 扩增子的长度应不超过400bp，理想的更好能在100－150bp内，扩增片断约短，有效的扩增反应就越容易获得。较短的扩增片断也容易保证分析的一致性

3， 保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，及在SG分析中非特异信号。

4， 为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）

5， 将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

b），探针设计指导

1，在设计引物之前设计探针

2，探针的Tm值应在68－70℃之间，如果是目测探针，则要仔细审查GC富含区。

3，探针的5’端要避免有鸟氨酸，5’G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还会存在

4，选择C多于G的链作探针，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

6， 探针应尽可能的短，不要超过30个bp。

7， 检测探针的DNA折叠和二级结构。

c), 引物设计指导

1，引物的Tm值应在58－60℃之间，这非常重要，因为我们的试验一般都使用退火温度为60℃，在这个温度下，5’核酸外切酶的活性更高。

2，引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

3，将引物尽量接近于探针

d循环参数

当引物和探针按照上述原则设计好后，循环的参数也就确定了，当经过起始的变性温度后(根据Tag酶要求设定)，反应要经过95℃，15－20秒，60℃60秒，对于一些模板，45秒也足够了。数据在退火时检测。

e)怎么优化探针和引物的浓度

对于双探针反应，通过选择探针和引物的浓度来优化反应结果，，能获得更低的CT值，以及相对于背景来说荧光值有更高的增长。

引物浓度应该在50nM -900nM 范围内进行优化，下面的表格显示了前后引物9种可能浓度组合的结果

探针浓度应该在50－250nM范围内优化

前引物

后引物 50 300 900

50 50/50 300/50 900/50

300 50/300 300/300 900/300

900 50/900 300/900 900/900

探针的浓度应该从（50，100，250nM）与9种引物浓度相组合，也既是27种可能根据前面所述的循环参数，在Rotor-Gene上进行试验，

选择最小CT值和更高反应扩增的曲线做后续试验。

g) 进一步的提示

通常所用的探针和引物浓度分别为250nM 和900nM，绝大多数反应都可以在这个浓度下进行，但为了寻找更佳的浓度，还是应该依照上述的步骤。

由于引物溶解温度预测的差异和多种探针设计程序，因此使用三种退火温度（58，60，62℃）对优化是很有用的。

引物的浓度也会影响溶解温度，高的引物浓度会让溶解温度提高2度左右。

Primer3是个非常有用的软件，但他不能避免3‘端的G，所以我们将3’端的G去除，并观察探针的退火温度是否比引物高8－10度。

f)定量数据的分析

分析定量数据主要有两种基本的 ***

i)绝对定量

ii)相对定量

研究人员应该根据扩增子和试验目的来决定如何分析定量数据

h) 绝对定量

绝对定量是将未知样品与标准曲线相比较进行分析，一般标准品就是一个已知绝对浓度的DNA样品，关于何种标准品用于标准曲线一直有很多讨论，理想的标准品其扩增方式应该是与待测样品一致得，然而这往往是不可能的。一些人会克隆他们得目的基因，并与未知样品比较。要注意得是，绝对定量分析的准确性是依靠标准品的准确性得。

在Rotro-Gene 上可以用几种 *** 来分析绝对定量数据。包括标准曲线在内的，R值，反应效率都会被呈现出来。也可以从以外的分析中调用标准曲线并让它与一个标准品相调整，（或重复相同的标准品），这个功能在确定斜率的重复性好与Y截距的基础上完成。对一个标准曲线来说，一个单独的标准品就已经足够了。我们也可以在不同的通道甚至一个通道内绘制多条标准曲线。最后提到的功能主要是为了那些想用SYBR-Green分析两个基因的使用者。

ii)相对定量

相对定量是指两个或更多的基因互相进行比较，其结果是一个比率。没有确切的数字被检测道。一种检测基因表达相对定量的 *** 叫“比较CT值法（⊿⊿Ct）

这种 *** 可以彻底不需要标准曲线，通过观察与一个动态相关对照比较的表达水平（normalizer），从而可以将模板与增加的样品间进行相对定量。要使这种 *** 成功，目的及参照的动态范围应该相类似。相对的一个敏感的 *** 就是看⊿Ct（相同的起始模板浓度，两个扩增子的两个CT值的差异）随着不同稀释度的模板有什么变化。如果两个扩增子的反应效率大致相同，则the plot of log input amount versus ⊿Ct 将是一条水平线（斜率0.01）。这以为着在初始模板浓度范围内，两个扩增子有相同的反应效率。如果检测发现效率不一致，则应该用标准曲线来对基因表达进行定量，或优化反应使得获得一个类似的效率。动态范围应该有下面两点决定（1）目的基因使用最小和更大的浓度其结果都是准确的（2）两个基因的最小和更大的定量比值都是准确的）

labview 主要用来干吗的啊？

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本书介绍的技术非常易于理解。如果学会，那么我们认为每个人都能够成功运用其中之一二。我们的目的是通过易于理解和可应用的方式向大家介绍和解释使用LabVIEW进行软件设计的概念。许多技术和 *** 学都拘泥于计算机科学理论，从而忘记了设计的初衷，我们却一直关注设计并希望能够说明某些计算机科学理论。

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